5味中药对鸡大肠杆菌的体外抑菌试验

来源:http://www.jemmvision.com 作者:行业新闻 人气:130 发布时间:2019-11-22
摘要:鸡大肠杆菌病是指由埃希氏大肠杆菌的某些致病性菌株引起的鸡的多种疾病的总称, 是威胁我国禽类养殖业的重要传染病之一。鸡大肠杆菌病临床有多种表现形式, 其中以急性败血型、

  鸡大肠杆菌病是指由埃希氏大肠杆菌的某些致病性菌株引起的鸡的多种疾病的总称, 是威胁我国禽类养殖业的重要传染病之一。鸡大肠杆菌病临床有多种表现形式, 其中以急性败血型、 卵黄性腹膜炎和生殖器官损害较常见, 危害性也最为严重。由于大肠杆菌病病原血清型复杂且抗药菌株的不断出现, 给该病的防治带来很大困难, 造成禽类的大批发病和死亡, 给畜牧业造成巨大的经济损失。而中药因为成分多样, 其在禽类疾病防治上的疗效优势越来越明显, 且中药的有多种成分和生物活性物质, 兼有药物和营养的双重作用等特点。采用黄连、 连翘、紫花地丁、 黄芩和白头翁 5味中药体外抑菌的试验方法, 检验其对鸡致病性大肠杆菌的抑菌效果, 从而为临床应用提供一定的基础依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 药物
黄连、 连翘、 紫花地丁、 黄芩和白头 翁 5味中药, 购于新乡市药材公司。
1. 1. 2 动物
18~ 20 g的试验用小白鼠 20只, 购于新乡医学院实验动物中心。
1. 1. 3 试剂
普通营养琼脂和营养肉汤, 河南科技学院动科学院微生物实验室自制; 葡萄糖、 麦芽糖、 乳糖、 甘露糖、 蔗糖等发酵试剂及生化试剂, 市售。
1. 1. 4 菌株
2010年 1月, 新乡县洪门镇某养殖户送检的病鸡, 羽毛粗乱, 精神委顿, 食欲减退, 拉白色稀粪, 据养殖户说已经发病 5d, 每日死亡 20多只, 疑为大肠杆菌病, 其间用过恩诺沙星饮水, 但仍有鸡死亡, 病情没有得到完全控制, 且附近的养殖场亦有相似病情出现。经剖检, 可见病鸡肝脏肿大, 质地变硬, 有针尖大小的出血点, 有的肝脏表面覆有白色纤维素膜, 小肠黏膜充血, 内容物糜烂, 心包发炎增厚, 有的气囊增厚浑浊, 表面有黄白色粟米状物,初步判断为鸡大肠杆菌病。
1. 1. 5 器材
SH P160型生化培养箱和 DHG91013SA 型电热恒温鼓风干燥箱, 上海三发科学仪器有限公司; SYQ280型高压蒸汽灭菌锅, 上海申安医疗器械厂; HH6型恒温水浴锅, 金坛市杰瑞尔电器有限公司; 电子分析天平、 普通光学显微镜、 无菌操作台、 粉碎机、 酒精灯、 接种环、 培养皿、 纱布、 砂锅、 注射器、 镊子、 解剖刀等。
1. 2 方法
1. 2. 1 单味药液的制备
试验采用中药水煎剂。先将经筛选的中药分别粉碎到适当程度, 然后用100目筛过筛, 各称取 50 g, 分别加入 6倍量的蒸馏水浸泡 30m in, 加热至沸腾, 然后改用文火继续煎煮, 30m in后趁热过滤 ( 4层纱布 ), 滤渣另外加 4倍量蒸馏水, 同法煎煮, 过滤, 合并 2次滤液, 水浴浓缩后凉至室温, 用 50m L容量瓶定容后进行高压灭菌,制得每 1mL 相当于原药材 1 g( 1 1)的中药水煎液, 备用 [ 1]。
1. 2. 2 药敏片的制备
用无菌镊子将灭菌干燥的圆形滤纸片 ( d= 6mm ) 分别摊布于 5个灭菌平皿中, 每个平皿注入 1种浓缩药液, 浸泡 30m in后取出纸片, 置于 30 干燥箱中烘干, 烘干后立即装入无菌小瓶中并于 4 温度下保存备用。
1. 2. 3 菌株的分离培养与鉴定
取病死鸡的肝脏、 心血等病料, 接种于普通营养琼脂平板, 置于37 恒温箱内培养 24 h后取出, 观察平板上菌落的形态、 大小、 颜色及排列方式。选取不同形状和颜色的菌落接种于营养肉汤培养基, 37 震荡培养 24 h后选取混浊均匀, 底部有白色粘稠沉淀, 轻摇呈云雾状散开, 且有粪臭味的做斜面划线, 然后把纯培养物进行增菌培养 [ 2] , 将纯培养物制片、革兰氏染色后镜检并观察其特性。
1. 2. 4 菌株的生化鉴定
1) 糖发酵试验。取纯培养物分别接种葡萄糖、乳糖、 麦芽糖、 甘露醇和蔗糖发酵管, 37 培养 2 ~3 d, 观察结果。
2) 吲哚试验。取纯培养物接种蛋白胨水 (可用固体或半固体培养基 ), 37 培养 2 ~ 3 d, 加入吲哚指示剂, 凡在层内出现玫瑰红色者为阳性, 不变色者为阴性。
3) MR及 VP试验。取纯培养物接种葡萄糖蛋白胨水, 37 培养 2~ 3 d, 分别加入 MR 和 VP指示剂, 观察结果。
4) 枸橼酸盐试验。取纯培养物接种枸橼酸盐培养基上, 37 培养 18~ 24h, 观察颜色变化, 凡有细菌生长, 培养基变为天蓝色者为该菌利用枸橼酸盐, 为阳性, 否则为阴性反应。
5) 硫化氢试验。取纯培养物接种醋酸铅琼脂,37 培养 18~ 24 h, 观察结果, 凡出现黑色沉淀者,为阳性反应, 无黑色者为阴性反应。
6) 甲基红试验。挑取新的待试纯培养物少许,接种于通用培养基, 于 ( 36 ! 1) 或 30 (以 30较好 )条件下培养 3 ~ 5 d, 从第 2天起, 每日取培养液 1mL, 加甲基红指示剂 1~ 2滴, 阳性呈鲜红色,弱阳性呈淡红色, 阴性为黄色。迄至发现阳性或至第 5天仍为阴性即可判定结果。
7) 动力试验。观察半固体琼脂培养管, 凡有鞭毛能运动者, 则部分或全部半固体琼脂浑浊, 不运动者仅在穿刺线上生长, 穿刺线外围培养基仍然透明。
1. 2. 5 致病性检验
将 20只试验用小白鼠随机分为 A、 B 两组, 每组 10只, 其中 A 组为试验组, B组为对照组。试验组腹腔接种分离菌株的 24h肉汤增菌培养物, 每只 0. 2m L; 对照组接种相同剂量的灭菌营养肉汤, 隔离饲养并观察其发病情况及死亡时间。对死亡小鼠剖检后取肝、 心血等病料进行分离培养, 回收到大肠杆菌。
1. 2. 6 药敏试验
用灭菌生理盐水将增菌培养液稀释为攻毒菌液, 接种于琼脂平板, 用灭菌镊子以无菌操作取出药敏片均匀贴在涂有菌液的琼脂平板上, 两片间距 1~ 2 c m, 距平皿边缘 1. 5 cm。将平皿放入 37 恒温箱中, 培养 16~ 18 h后观察药敏片周围有无抑菌环, 同法做 4组 ( A ~ D)后, 分别量取直径, 记录并计算平均抑菌直径。
2 结果与分析
2. 1 大肠杆菌的培养特性
大肠杆菌 (E. coli. )为革兰氏阴性、 两端钝圆的短杆菌, 多呈单个或成对存在; 不形成芽胞, 大多数菌株具有周鞭毛, 能运动, 多数菌株还长有菌毛, 部分菌株有荚膜或微荚膜。大小一般为 ( 0. 4~ 0. 7)m ∀ ( 1. 0~ 3. 0) m。大肠杆菌在普通营养琼脂上生长良好, 经 37 培养 24h后, 长出边缘整齐、 表面光滑、 隆起湿润、 近似灰白色的不透明或半透明的圆形菌落, 直径约为 1. 0~ 3. 0mm; 在肉汤培养基中生 长良好, 培养几个小时肉汤即变混浊。
2. 2 致病性检验
试验结果表明, 小白鼠试验组接种 14h 后出现精神沉郁, 24 h 后开始死亡, 7 d 内共计死亡 9 只。对照组则无明显异常表现。对死亡小鼠进行剖检,可见心外膜出血, 肝出血肿胀。
2. 3 生化试验
从表 1可知, 生化试验中糖发酵试验均呈阳性;硫化氢试验出现黑色沉淀, 呈阴性; M R 试验呈阳性; 吲哚试验呈阳性; 甲基红试验呈阳性; VP试验呈阴性; 枸橼酸盐试验呈阴性; 动力试验呈阳性。

2. 4 药敏试验
从表 2看出, 5味中药对鸡大肠杆菌均有一定的抑菌活性, 其中, 以黄连的抑 菌直径最大, 为15. 5mm, 高敏; 白头翁、 连翘和紫花地丁次之, 分别为 14. 0mm、 13. 0mm 和 12. 2mm, 敏感程度均为中敏; 黄芩的抑菌直径最小, 为 10. 1mm, 敏感程度为低敏。 3 小结与讨论
1) 体外抑菌试验结果表明: 黄连等 5味中药对鸡大肠杆菌均有一定的抑菌活性, 其中, 黄连的抑菌直径为 15. 5mm, 抑菌活性最强; 白头翁、 连翘和紫花 地 丁 次 之, 分 别 为 14. 0mm、13. 0mm 和12. 2mm; 黄芩的抑菌活性较弱, 为 10. 1mm。
2) 中药水煎剂的制备过程中, 由于受粉碎程度、 煎煮次数以及煎煮中的损耗等原因, 致使中药的利用效率不高, 有可能影响试验结果, 这也是目前中药仍未能广泛应用到实际生产中的原因之一。另外, 某些操作以及试验材料和试验环境上的一些问题也可能会影响本次试验结果。
3) 中药来源广泛, 价格便宜, 毒副作用小, 无耐药性, 应用时强调调节整体功能, 提高机体自身的免疫能力, 长期应用安全可靠, 但是中药的利用效率不高, 加工工艺落后, 且有效成分相差很大, 使其产品难以进行准确的药效评价和质量控制; 为了保证人畜健康, 寻求中西药结合的规律性, 取长补短, 相互协调, 将是未来发展的主要方向。

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